[생물학실험] Midi prep protocol

[ Midi prep ] standard protocol

Step 1. Spread plate (comp cell + DNA + LB/ 1 hour)
Step 2. Mini culture (pick the colony & put into LB(3ml)+AMP(3ul)/ shaking)
Step 3. Midi culture (put 100-200ul mini culture in LB 100ml (500ml flask)/ shaking overnight)
Step 4. Midi prep (using kit) 

Preparation

1. Autoclave 완료한 500ml flask

2. LB media 
    1) LB-media(in 시약냉장고) 4capsule/1L (autoclave 된 500ml 플라스크 사용 권장)
       ex) 500ml LB media 만드는 법> 3차 증류수 500ml + LB media 2 capsule
    2) Autoclave 121˚C 5번(liquid)로 돌리기.

3. Ampicillin (Amp)
    -20˚C 냉장고에 aliquot해서 얼려둔 Amp (100mg/ml) 있음.

4. LB-agar plate
    1) LB-agar media(in 시약냉장고) 8capsule/1L (autoclave 된 500ml 플라스크 사용 필수)
       ex) 500ml LB-agar media 만드는 법> 3차 증류수 500ml + LB media 4 capsule
    2) Autoclave 121˚C 5번(liquid)로 돌리기.
    3) 손으로 만질 수 있을 정도로 식힌 후에 Amp을 1000:1의 비율로 넣음. (500ml LB + 500ul Amp)
       Amp resistance이기 때문에 Amp을 넣어주는 것임.
    4) plate에 적당히 넣고 하루 동안 Room Temperature에서 굳히기. 조금 굳혔으면 뒤집어서 굳히는 것이 좋음.
       plate 1개에 20ml 정도 깔리기 때문에 25개 plate 만들 수 있음.
    5) 다음날 아침에 plate sealing 해서 4˚C 냉장고에 넣어둠.

5. heat block 4˚C, 42˚C 미리 setting 해두기

6. LB medium (or S.O.C medium) room temperature로 warming 시키기

7. plate 37˚C incubator에서 warming 시키기 (넉넉하게 2시간)

Step 1. Spread plate (Comp cell + DNA + LB/ 1 hour)

Competent cell은 각자가 사용하는 제품의 Protocol를 사용하면 됨.
여기서는 Comp cell로 Stbl3을 사용했기 때문에 이에 대한 protocol을 기재함.
오후 4시에 시작!

1) Stbl3를 ice (heat block 4˚C) 에서 녹인다.

2) 녹인 stbl3 전체(50ul)와 vector library DNA 1ul를 1.5ml microtube에 옮긴 후, gently mix한다.
   (Do not mix by pipetting up and down.)

3) ice (heat block 4도)에서 30분 동안 놓는다.

4) 42도에서 45초 동안 heat-shock을 준다.

5) ice (4도)에서 2분 동안 놓는다.

6) 1.5ml tube에 pre-warmed S.O.C medium을 250ul 넣는다. 
   (LB = S.O.C; 둘다 bacteria가 자라기 위한 밥이라고 생각하면 됨.)

7) shaking incubator에 37도 225 rpm으로 1시간 동안 둔다.

8) spread 5ul, 10, 25, 50, 100 ul를 plate에 뿌리고 구슬을 넣고 흔든다. 
   (2시간 전에 plate warm 시키기)

9) 남은 80ul (=300ul - 220ul) 용액은 4도씨에 보관 했다가 다음날 또 뿌려도 됨!

10) 37도 incubation에서 12~16시간 colony 키우기. 
   (colony 크기에 따라서 시간은 좀 더 유동적으로 해도 됨. colony가 작으면 더 키우고..)

다음날 오전 9시-10시에 확인! (12시간~16시간 키우는 것 추천)

Compcell_oneshot_stbl3_man.pdf

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Step 2. Mini culture (pick the colony & put into LB(3ml)+AMP(3ul)/ shaking)

다음날 오전 9시-10시에 plate 확인!

1) Colony 자란 상태를 확인하고 예쁘고 동그랗게 하나만 뜬 colony를 200ul pipette tip으로 pick한다.  

2) Falcon 14ml tube에 LB 3ml + Amp 3ul (1000:1)을 넣고 pick한 colony를 tip째로 넣어준다.  
   cf) colony를 여러개 pick할 것이기 때문에 몇 개를 pick 할지 생각한 후, master mix를 만들고 넣어주면 좋다.

3) 37˚C shaking incubation에 8시간 동안 키운다. 

오후 5-6시까지 키우고 확인!

Step 3. Midi culture (put 100-200ul mini culture in LB 100ml (500ml flask)/ shaking overnight)

오후 5-6시 Midiculture 시작!

1) 500ml flask에 LB 100ml + Amp 100ul을 넣고, mini culture로 키운 LB bacteria를 200ul 넣는다.
   cf) 총 3003ul 중에 200ul를 사용하므로 남는 용액으로 Mini prep 진행해도 좋다. (선택사항)

2) 12~16시간 동안 37˚C shaking incubator에서 키운다. 

다음날 오전 10시 확인!

Step 4. Midi prep (using kit; GENEALL> LE Midi prep (p21))

LE 라고 표기되어 있는 것은 endotoxin free kit 임.
Cloning 할 때는 endotoxin free를 사용해야 하므로 우리 연구실은 LE kit를 사용하고 있음.
그래서인지 농도가 낮게 나옴. 그냥 DNA 잘라 붙이는 용도로는 yield가 잘나오는 endotoxin free가 아닌 kit를 새로 사도 될 듯 함.

[ Preparation ]

- P1에 RNase A를 넣고 4도씨 냉장고에 보관
- P2와 G3는 주변에 차가운 것이 있으면 침전됨. 만약 침전이 되었다면 37도 water bath에 녹여주기.

[ Temperature ]

- 모든 실험은 room temperature에서 진행하기

[ Centrifugation ]

- 따로 온도가 적혀있는 것이 아니면 모든 centrifugation 단계는 room temperature에서 실행되어야함.  

[ Preparation of Cleared Lysate ]

• 이 protocol은 50ml를 기준으로 작성된 것이기 때문에 자기에게 맞게 비율을 계산해서 실험 진행하면 됨.
  ex) 만약 45ml bacterial culture을 centrifugation 했다면, 45ml/50ml = 0.9 (용액도 x 0.9 값으로 넣어주기, P1 2.25ml, P2 2.25ml, G3 3.15ml)
• 5분 동안 4,500xg (5,000 rpm) -> 10분 동안 3134xg (우리 기계 최대)

1) 50ml bacterial culture를 20분 동안 4000xg (기계가 되는 한 최대로)로 centrifugation 한다. 상층액은 모두 버린다.

2) P1 2.5ml 를 넣고, pelleted bacterial cell를 완전히 부유시킨다. (vortexing)

3) P2 2.5ml 를 넣고, tube를 4번 inverting 시킨다.

4) G3 3.5ml (x0.9: 3.15ml)를 넣자마자 5-8번 gently mixed by inverting tube 한다.

[ Isolation and Purification of plasmid DNA – Centrifugation protocol ]

Blue ring은 Pass through해서 아래로 내려온게 중요한 것이고,
Clear ring은 cloumn에 붙어있는 것이 중요한 것임.

5) 모든 lysate or cleared lysate를 EzClear filter unit (blue ring)에 붓고, 아래에 주어진 50ml 코니칼 튜브를 아래에 둔다.  
   2분 동안 incubation 한 후에 2분 동안 1,500xg (2,800 rpm) centrifuge 한다.
  (cell debris는 incubation 동안 위로 떠오를 것이고, 이는 EzClear Filter Unit을 통해 clearing of lysate가 되는 것을 도와줌.)

6) SV Midi column (clear ring)에 pass-through fraction을 조심스럽게 부어라. 
   2분 동안 1,500xg (2,800 rpm) centrifuge 한다. 
   SV column을 제거하고, pass-through 된 것을 버리고, SV column을 다시 collection tube에 삽입시킨다.
  (높은 농도의 eluate를 위해서는 6번에서 나온 pass through를  SV column membrane에 re-load 하고, 
   뚜껑을 닫고 5분 동안 incubation 후에, 5분 동안 4,500xg (5,000 rpm) (연구실 기계로는 10분 동안 3,134xg) 으로 돌린다.)

7) EW1 10ml 를 첨가한 후 2분 동안 1,500xg (2,800 rpm) centrifuge 한다. 
   SV column을 제거하고, pass-through 된 것을 버리고, SV column을 다시 collection tube에 삽입시킨다.
   (이 과정은 endotoxin, endonucleases, protein, carbohydrates, other cellular components 을 제거하는 과정임.)

8) EW2 10ml를 첨가하고,  2분 동안 1,500xg (2,800 rpm) centrifuge 한다. 
   SV column을 제거하고, pass-through 된 것을 버리고, SV column을 다시 collection tube에 삽입시킨다.

9) EW2 3ml를 첨가하고, 15분 동안 4,500xg (5000rpm) (연구실 기계로는 22분 동안 3,134xg) centrifuge 한다. 
   SV column을 새로운 50ml conical tube 에 옮긴다. (제공되지 않음.) 
  (EW2 로 부터 carryover of ethanol이 생길 수 있음. 만약 carryover of ethanol이 생긴다면 다음 스텝에 영향을 줄 수 있으니 
   10~20분 동안 SV column을 incubate 해주면 된다.)

10) SV column membrane 중앙에 EF 0.6ml 을 직접 directly하게 넣는다. 
    5분 동안 room temperature에 놓고, 5분 동안 4,500xg (5,000 rpm) (연구실 기계로는 12분 동안 3,134xg) 을 돌린다. 

[ CAUTION ]

최적의 DNA 용출을 위해 buffer EF 또는 증류수를 SV 컬럼 막의 중앙에 직접 넣어야 한다.
높은 농도의 DNA를 추출하고 싶다면 0.6ml 보다 적게 넣어도 된다.
하지만 전체 막을 적시기 위해서 최소 0.5ml의 EF를 넣어야 한다. (근데 더 적게 넣어도 상관 없을거 같아..)
장기 보관의 경우 완충액 EF (10mM TrisCl, pH 8.5)에서 용출하고 -20˚C에서 보관하는 것이 좋다.
EF는 DNA가 깨지지 않게 오래 보관할 수 있도록 하는 용액이기 때문에 물 대신 이걸 사용하는 걸 추천하는 것이다.)

 

Geneall_Mini_Midi_prep_protocol.pdf

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