[생물학실험] Maxi prep protocol (one DNA)

[ Maxi prep ] standard protocol

Step 1. Spread plate (comp cell + DNA + LB/ 1 hour)
Step 2. Mini culture (pick the colony & put into LB(3ml)+AMP(3ul)/ shaking)
Step 3. Midi culture (put 100-200ul mini culture in LB 100ml (500ml flask)/ shaking overnight)
Step 4. Midi prep (using kit) 

Preparation

1. Autoclave 완료한 500ml flask

2. LB media 
    1) LB-media(in 시약냉장고) 4capsule/1L (autoclave 된 500ml 플라스크 사용 권장)
       ex) 500ml LB media 만드는 법> 3차 증류수 500ml + LB media 2 capsule
    2) Autoclave 121˚C 5번(liquid)로 돌리기.

3. Ampicillin (Amp)
    -20˚C 냉장고에 aliquot해서 얼려둔 Amp (100mg/ml) 있음.

4. LB-agar plate
    1) LB-agar media(in 시약냉장고) 8capsule/1L (autoclave 된 500ml 플라스크 사용 필수)
       ex) 500ml LB-agar media 만드는 법> 3차 증류수 500ml + LB media 4 capsule
    2) Autoclave 121˚C 5번(liquid)로 돌리기.
    3) 손으로 만질 수 있을 정도로 식힌 후에 Amp을 1000:1의 비율로 넣음. (500ml LB + 500ul Amp)
       Amp resistance이기 때문에 Amp을 넣어주는 것임.
    4) plate에 적당히 넣고 하루 동안 Room Temperature에서 굳히기. 조금 굳혔으면 뒤집어서 굳히는 것이 좋음.
       plate 1개에 20ml 정도 깔리기 때문에 25개 plate 만들 수 있음.
    5) 다음날 아침에 plate sealing 해서 4˚C 냉장고에 넣어둠.

5. heat block 4˚C, 42˚C 미리 setting 해두기

6. LB medium (or S.O.C medium) room temperature로 warming 시키기

7. plate 37˚C incubator에서 warming 시키기 (넉넉하게 2시간)

Step 1. Spread plate (Comp cell + DNA + LB/ 1 hour)

Competent cell은 각자가 사용하는 제품의 Protocol를 사용하면 됨.
여기서는 Comp cell로 Stbl3을 사용했기 때문에 이에 대한 protocol을 기재함.
오후 4시에 시작!

1) Stbl3를 ice (heat block 4˚C) 에서 녹인다.

2) 녹인 stbl3 전체(50ul)와 vector library DNA 1ul를 1.5ml microtube에 옮긴 후, gently mix한다.
   (Do not mix by pipetting up and down.)

3) ice (heat block 4도)에서 30분 동안 놓는다.

4) 42도에서 45초 동안 heat-shock을 준다.

5) ice (4도)에서 2분 동안 놓는다.

6) 1.5ml tube에 pre-warmed S.O.C medium을 250ul 넣는다. 
   (LB = S.O.C; 둘다 bacteria가 자라기 위한 밥이라고 생각하면 됨.)

7) shaking incubator에 37도 225 rpm으로 1시간 동안 둔다.

8) spread 5ul, 10, 25, 50, 100 ul를 plate에 뿌리고 구슬을 넣고 흔든다. 
   (2시간 전에 plate warm 시키기)

9) 남은 80ul (=300ul - 220ul) 용액은 4도씨에 보관 했다가 다음날 또 뿌려도 됨!

10) 37도 incubation에서 12~16시간 colony 키우기. 
   (colony 크기에 따라서 시간은 좀 더 유동적으로 해도 됨. colony가 작으면 더 키우고..)

다음날 오전 9시-10시에 확인! (12시간~16시간 키우는 것 추천)

Compcell_oneshot_stbl3_man.pdf

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Step 2. Mini culture (pick the colony & put into LB(3ml)+AMP(3ul)/ shaking)

다음날 오전 9시-10시에 plate 확인!

1) Colony 자란 상태를 확인하고 예쁘고 동그랗게 하나만 뜬 colony를 200ul pipette tip으로 pick한다.  

2) Falcon 14ml tube에 LB 3ml + Amp 3ul (1000:1)을 넣고 pick한 colony를 tip째로 넣어준다.  
   cf) colony를 여러개 pick할 것이기 때문에 몇 개를 pick 할지 생각한 후, master mix를 만들고 넣어주면 좋다.

3) 37˚C shaking incubation에 8시간 동안 키운다. 

오후 5-6시까지 키우고 확인!

Step 3. Midi culture (put 100-200ul mini culture in LB 100ml (500ml flask)/ shaking overnight)

오후 5-6시 Midiculture 시작!

1) 500ml flask에 LB 500ml + Amp 500ul을 넣고, mini culture로 키운 LB bacteria를 500ul 넣는다.
   cf) 총 3003ul 중에 500ul를 사용하므로 남는 용액으로 Mini prep 진행해도 좋다. (선택사항)

2) 12~16시간 동안 37˚C shaking incubator에서 키운다. 

다음날 오전 10시 확인!

Step 4. Maxi prep (using kit; INtRONbio protocol endotoxin free)

[ Kit contents ]

Components	10 prep
M1 Buffer (Resuspension buffer)1	215 ml
M2 Buffer (Lysis buffer)2	215 ml
M3 Buffer (Neutralization buffer)	215 ml
EQ(Equilibration) Buffer	135 ml
ER(Endotoxin Remove) Buffer	55 ml
Washing Buffer	270 ml + 60 ml
Elution Buffer	215 ml
RNase A3	21.5 mg
Maxi Column	10 pcs
Storage Conditions : Room Temperature

• Briefly spin the dissolved RNase A solution and add the RNase A solution to M1 Buffer. Before use, store M1 Buffer at 4℃after adding RNase A solution.
• Check M2 Bufferfor SDS precipitation(침전) due to low storage temperature in which case it is necessary to dissolve the SDS by warming at 37℃.
• RNase A can be stored at room temperature (15-25℃) for one year.

[ Specification ]

• Technology : Anion-exchange chromatography (gravity-flow column)
• Lysate clarification (용해물 정화): Centrifugation
• Sample Size : 120 ~ 240 ml of bacteria for high-copy number or low-copy number plasmid
• Plasmid or constructs range : 3kbp ~ 150kbp
• Binding Capacity : 1.5 mg / Maxi Column

[ Important notes ]

• Store RNase A at -20 °C upon recipit of kit.
• Add 0.5 ml of M1 Buffer to a RNase A tube and vortex the tube to mix well.
• Transfer the total RNase A mixture back to the M1 bottle and mix well by vortexing. Store the M1 buffer at 4 °C.
• If precipitates have formed in M2 Buffer, warm the buffer in 37°C waterbath to dissolve preciptates.
• Pre-chill M3 Buffer at 4 °C before starting.

[ Addtional requirement ]

• 50ml tubes
• Refrigerated centrifuge capable of ≥ 5,000 x gand the centrifuge tube suitable for the centrifuge rotor
• Isopropanol (in 시약냉장고, 소분시켜서 보관하는게 좋음)
• 70% ethanol (in 시약냉장고, 99% ethanol이기 때문에 희석시켜서 사용)
• TE bufferor ddH2O (auto 3차 증류수)

[ Diagram of experiment ]

[ Preparation of Cleared Lysate ]

• M1, M2, M3 Buffer volume을 culture volume에 비례하게 증가시킨다.
• ex) culture volume이 120 - 240ml이면, M1, M2, M3가16ml 넣고,
        culture volume이 240 - 480ml이면, M1, M2, M3가32ml 넣어라.  

• cell pellet이 M1에 완전히 뜨는지 확인해라. M2와 M3를 첨가 한 후, sample mixture를 완전히 섞는다.
• 연구실 centrifuge 기계 최대 RCF는 3134xg 이므로 시간을 증가시켜서 돌려야 한다.

1) 50ml bacterial culture를 20분 동안 3134xg 로 centrifugation 해서 cell harvest 한 후, 상층액은 모두 버린다.(RCF: 3134xg 이 연구실 기계 최대치임.) maxi prep에서는 200ml bacterial culture가 필요하기 때문에 하나의 conical tube에 50ml씩 4번 centrifuge 시키면 된다. 

2) Maxi column을 50ml conical tube 위에 놓는다. 

3) EQ 10ml를 넣어서 maxi column을 적셔놓는다. 
    # Equilibrate: 농도와 평형을 맞춰주는 단계.

4) M1 16ml를 넣고, cell pellet을 resuspend 시킨다. (vortexing or pipetting)
    # RNase A가 추가된 M1 사용하기.

5) M2 16ml를 넣고, 5번 gently mixed by inverting tube 한다. (NO vortexing)
    # Genomic DNA 절단을 피하기 위해 mix gently.

6) lysate clears가 될 때까지 sample mixture을 5분 동안 상온에 incubate한다.

7) M3 16ml를 넣자마자 10~15번 gently mixed by inverting tube 한다. (NO vortexing)
    # Neutralize the lysate를 위한 단계.
    # 실험 전에 M3 냉장고에 잠깐 넣어서 차갑게 하기

[ Isolation and Purification of plasmid DNA – Centrifugation protocol ]

이 과정부터는 무조건 centrifuge기계를 4˚C로 설정한다.

8) 4˚C에서 35분 동안 3,134xg 로 centrifuge 시킨다.
    # centrifuge 후에도 상층액에 부유물이 계속 있으면, 상층액을 새로운 centrifuge tube에 옮긴 후, 8) centrifugation step을 반복한다.)

9) 상층액을 새로운 50ml conical tube에 옮긴다.

10) ER 5ml를 넣고, mix gently by pipetting 한다. sample mixture를 ice(4˚C)에 30분 incubate한다. incubation 후에 sample mixture가 투명해질 것이다.

11) 10) sample mixture의 1/2를 3)에서 적셔놓은 equilibrated Maxi Column으로 옮긴다. sample mixture가 중력 흐름에 의해 maxi column을 통과하도록 하고, column을 통과한 여과액은 버린다. 
    # 시간 완죠니 오래 걸림. 휴.

12) 남은 sample mixture에 대해 11)을 반복한다. 

13) washing buffer 30ml을 넣고, maxi column을 세척한다. washing buffer가 중력 흐름에 의해 maxi column을 통과하도록 하고, column을 통과한 여과액은 버린다. 

14) maxi column을 깨끗한 50ml centrifuge tube (제공되지 않음) 위에 둔다. Elution buffer 15ml를 maxi column에 넣고, 중력 흐름에 의해 통과하도록 한다. 
    # plasmid를 녹여서 분리시키기 위한 단계.
    # 이 단계가 column 사용 끝! 15)부터는 column을 통과해서 나온 여과액이 중요함.

15) 14)에서 column을 통과한 용액을 새로운 centrifuge tube로 옮긴다. 여기에 실온 isopropanol을 0.75 volume만큼 넣고, tube를 10번 mix well by inverting 한다.
    # 15ml elution buffer + 11.25ml isopropanol (15 x 0.75 = 11.25) 

16) 4˚C에서 40분 동안 3,134xg 로 centrifuge 시킨다. 

17) 조심스럽게 상등액을 따른 후, 5ml 실온 70% ethanol을 넣고, 15번 gently mixed by inverting tube 한다.
    # plasmid pellet을 씻는 단계.

18) 4˚C에서 15분 동안 3,134xg 로 centrifuge 시킨다.

19) 조심스럽게 상등액을 따른 후, 남아있는 ethanol을 제거하기 위해서 튜브를 3분 동안 paper towel에 거꾸로 뒤집어 놓는다. 튜브가 완전히 마를 때 까지 plasmid pellet을 공기로 건조시킨다. 
    # 또는 70˚C에 10분 동안 둔다. (20분은 해야 완벽하게 마름.)
    # 하지만 pellet이 떨어질 수도 있으니 거꾸로 뒤집어 놓지 말고, 옆으로 눕혀 놓는 것이 좋다고 함.
    # ethanol이 마르지 않고 다음 단계를 진행하면 농도가 낮게 나온다고 함.

20) plasmid pellet에 TE 또는 auto 3차 증류수 ≥ 300ul 을 넣는다.
    # 50ml conical tube에서 1.5ml microtube로 옮긴 후, 농도를 재고 sealing 해서 -20˚C에 보관.

[ NOTE ]

상등액을 버릴때, DNA pellet을 같이 버리면 안됨. centrifuge tube에서 DNA pellet이 잘 접착되어 있는지 확인하기. 만약 tube에서 DNA pellet이 loose해졌으면, 다시 18) centrifuge 단계를 반복해라.

INtRONbio_DNA-maxi Endotoxin-Free.pdf

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